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Issu du travail de thèse de Xavier Raffoux, un article publié dans Yeast expose la mise au point par l’équipe RAMDAM d’une méthode pour mesurer à haut débit et à faible coût le taux de recombinaison méiotique et l’interférence chez la levure S. cerevisiae.

La recombinaison méiotique

Les premières expériences de génétique ont été réalisées dès les débuts de l’agriculture : elles ont consisté à sélectionner comme reproducteurs les individus possédant les caractères qui correspondent le mieux aux attentes des premiers agriculteurs. Suite aux travaux de Mendel (1822-1884), Thomas Morgan (1866-1945) a observé que certains de ces caractères peuvent être déterminés par des facteurs génétiques (ou gènes) situés sur un même chromosome, mais qui peuvent pourtant se dissocier chez une partie des descendants. Ce réassortiment des facteurs génétiques a lieu lors de la reproduction sexuée, et plus précisément lors de la méiose, c'est-à-dire au cours de la fabrication des cellules reproductrices, les gamètes (ex. spermatozoïdes et ovules). Pour que chaque gamète contienne un jeu complet de chromosomes, des liens physiques sont créés lors de la méiose entre les deux exemplaires de chaque chromosome (homologues), l'un venant de la « mère » et l'autre du « père ». Ces liens conduisent à un échange réciproque de matériel génétique que l’on appelle recombinaison méiotique. C'est ainsi que deux caractères contrôlés par des gènes situés sur un même chromosome peuvent être séparés sur chacun des chromosomes homologues par un évènement de recombinaison méiotique, créant de nouvelles combinaisons de caractères chez les descendants qui n'existaient pas chez les parents.

Problèmatique

L’un des défis de la génétique moderne est d’identifier les régions du génome responsables de la variation de caractères d’intérêt. Pour cela, quelle que soit la méthode utilisée, les chercheurs exploitent les évènements de recombinaison méiotique se produisant de part et d’autre de la région ciblée. La précision de l’approche dépend donc essentiellement du nombre et de la position des points de recombinaison, afin d’identifier la plus petite région possible associée à un caractère. Les évènements de recombinaison n'étant pas répartis uniformément le long du génome, il est parfois difficile, voire impossible, de localiser les régions contrôlant un caractère, lorsque celles-ci sont situées dans une zone du génome peu ou pas recombinante. De même, il est quasiment impossible de sélectionner des individus possédant deux caractères contrôlés par des gènes situés dans une même région très peu recombinante, sauf à recourir à des méthodes biotechnologiques permettant de transférer un gène d’un individu vers un autre par le biais d'organismes génétiquement modifiés.

Ainsi, comprendre le déterminisme génétique du nombre et de la position des évènements de recombinaison est un enjeu crucial, que ce soit pour des études fondamentales ou pour les applications de sélection. Pour cela, un des verrous actuels est de pouvoir facilement mesurer (on parle de phénotypage), le nombre et la position des évènements de recombinaison méiotique.

Les méthodes actuelles permettant de compter et localiser les points de recombinaison (Crossing-over) sont encore coûteuses, financièrement et en temps. Il est donc très difficile de mesurer ce caractère sur un grand nombre d’échantillons. Il est encore plus difficile de mesurer l’intensité de l’interférence entre crossing-overs (les crossing-overs peuvent se repousser entre eux), puisque cette mesure nécessite de compter les rares cas où deux crossing-overs se produisent à proximité l'un de l'autre.

Choix de l’organisme modèle : S. cerevisiae

Une partie du travail de thèse de Xavier Raffoux a consisté à lever ce verrou technique : nous avons mis au point une méthode pour mesurer à haut débit et faible coût le taux de recombinaison et l’interférence chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons choisi cet organisme comme modèle pour les raisons suivantes :

  • son temps de génération est court (quelques jours pour obtenir des descendants à partir de deux parents) ;
  • il s'agit d'un micro-organisme qui permet de travailler sur des populations de plusieurs millions d’individus ;
  • S. cerevisiae est séquencée (c’est-à-dire que l’on connait la séquence de son ADN) ;
  • on dispose pour cet organisme de nombreux outils de biologie moléculaire ;
  • enfin, les mécanismes de la recombinaison méiotique  y sont très semblables à ceux des plantes et des animaux.

Construction du matériel biologique

Nous avons tout d’abord construit par manipulation génétique des souches exprimant trois marqueurs fluorescents localisés à différents emplacements de chromosomes de la levure. Ce travail a nécessité d’introduire dans des régions ciblées et uniques du génome des séquences d’ADN codant pour des protéines fluorescentes. illustration de la méthodeNous avons ensuite croisé entre elles ces différentes souches ainsi transformées puis sélectionné des descendants combinant plusieurs marqueurs (Figure 1 : exemple avec uniquement deux marqueurs fluorescents). Nous avons obtenu une collection de 8 souches de levure possédant chacune un marqueur à trois positions différentes d'un chromosome. Cette collection couvre les chromosomes VI et XI en totalité et le chromosome I partiellement.

Puis nous mesurons la recombinaison d'une souche issue du croisement entre l’une des huit souches de notre collection et une souche sauvage : après méiose et l’obtention de tétrades (regroupement de 4 gamètes entourés d’une paroi), les parois des tétrades sont cassées, et les cellules parentales résiduelles éliminées afin d’obtenir un mélange de spores (gamètes) libres.

Cytométrie de flux

illustration de la mesure

Pour avoir une mesure très précise du taux de recombinaison, il faut étudier la ségrégation des marqueurs fluorescents chez un grand nombre de spores. Nous avons donc utilisé un cytomètre de flux : cet appareil  fait défiler des cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser, pour mesurer leur fluorescence.

Nous avons mis au point un protocole pour ne mesurer que les spores isolées et non collées par groupes de deux ou trois cellules. Les données de cytométrie sur la ségrégation des marqueurs fluorescents dans la descendance nous permettent de mesurer la proportion de spores pour lesquels il y a eu recombinaison entre marqueurs (Figure 2). Le cytomètre de flux analyse des millions de spores en quelques minutes : la mesure du taux de recombinaison et de l’interférence se révèle très précise, rapide et peu coûteuse.

Un obstacle surmonté

Nous avons observé que certains phénomènes biologiques se produisent au niveau de l'ADN des levures et conduisent parfois à changer la couleur d'un marqueur fluorescent. Cet échange de marqueurs fausse les mesures, en particulier celle de l'interférence. Nous avons développé un modèle mathématique qui permet de mesurer précisément ce biais et d'en tenir compte pour obtenir les valeurs de taux de recombinaison et d'interférence non biaisées.

Conclusion

Ce travail apporte une contribution essentielle aux futurs  travaux sur le contrôle de la recombinaison méiotique chez S. cerevisiae puisqu’il est maintenant possible d’étudier la recombinaison méiotique et l'interférence à une large échelle.

Cela ouvre des perspectives telles que l’étude de la diversité du taux de recombinaison, ou bien encore l'étude des effets de facteurs environnementaux sur ce caractère.

Référence

Raffoux X., Bourge M., Dumas F., Martin O. C., Falque M. (2018) High throughput measurement of recombination rates and genetic interference in S. cerevisiae. Yeast, Epub ahead of print

> Contact

Matthieu Falque, équipe RAMDAM